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題目：上皮和基質(zhì)角膜硬度的變化隨年齡和肥胖而發(fā)生
（如果需要完整文獻(xiàn)請(qǐng)與我們工作人員聯(lián)系，可試樣）
簡(jiǎn)介：
角膜是無血管的，這使其成為研究基質(zhì)蛋白表達(dá)和組織硬度的模型。角膜上皮粘附在基底區(qū)，下面的基質(zhì)由角質(zhì)細(xì)胞和廣泛的膠原蛋白和蛋白聚糖基質(zhì)組成。我們的目標(biāo)是檢查8周和15周小鼠的角膜變化，并將其與15周前2型糖尿病肥胖小鼠進(jìn)行比較。對(duì)角膜上皮進(jìn)行納米壓痕原位，然后對(duì)上皮進(jìn)行磨損，并在基底膜和基質(zhì)上重復(fù)該過程。進(jìn)行共聚焦成像以檢查蛋白質(zhì)的定位。發(fā)現(xiàn)僵硬取決于年齡和肥胖。與8周小鼠相比，15周小鼠上皮的楊氏模量更大。在15周時(shí)，對(duì)照組的上皮明顯大于肥胖小鼠的上皮。Crb3和PKCζ在頂端上皮的定位存在差異，肥胖小鼠缺乏片狀延伸。在2型前糖尿病肥胖小鼠中，硬度斜率存在差異，損傷后纖連蛋白的定位可以忽略不計(jì)。這些表明，飲食引起的年齡和環(huán)境變化會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而改變組織的完整性，使其更僵硬。來自2型前糖尿病肥胖小鼠的角膜明顯較軟，這可能是由于頂端表面蛋白質(zhì)的變化表明缺乏完整性和纖連蛋白減少。
角膜上皮和基質(zhì)硬度用Piumanano壓痕系統(tǒng)（Optics11，阿姆斯特丹，荷蘭）測(cè)量。為了進(jìn)行測(cè)量，頭部被固定。將眼睛浸入磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，并將探針降低到角膜的中心。探頭的半徑為26μm，剛度為4.4 N / m。通過10μm壓痕進(jìn)行上皮測(cè)量。
為了檢查基底膜和基質(zhì)，對(duì)上皮進(jìn)行了磨損。使用各種壓痕深度進(jìn)行測(cè)量，范圍從1μm到17μm。使用基于赫茲接觸力學(xué)模型的內(nèi)置PIUMA軟件計(jì)算樣品的楊氏模量，假設(shè)角膜組織不可壓縮，泊松比為0.5。加載曲線通過軟件擬合到以下方程中：其中F表示施加的力，表示有效楊氏模量，表示球尖半徑，并表示壓痕深度。我們用于分析的體積楊氏模量是使用以下公式生成的：其中表示被測(cè)材料的泊松比。
在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們將8周和15周的小鼠與天然發(fā)生的小鼠肥胖模型（2型糖尿病小鼠前）進(jìn)行了比較，以檢查上皮和基質(zhì)硬度的變化。使用來自5只8周對(duì)照小鼠，5只15周對(duì)照小鼠和2只DiO 15周齡小鼠的雙眼。之前，我們證明了肥胖小鼠角膜的角膜上皮傷口修復(fù)受損[]。這些結(jié)果刺激我們檢查角膜的變化，這可能是細(xì)胞遷移和傷口修復(fù)變化的根本原因。在中，我們檢查了完整眼睛中上皮，基底膜和基質(zhì)的硬度。計(jì)算Young氏模量，15周C57Bl6小鼠的完整角膜上皮顯著大于8周小鼠的完整角膜上皮（Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，*** p < 0.01）。在同等年齡時(shí)，上皮顯著大于年齡匹配的DiO小鼠角膜（Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，*** p < 0. 01）。在這里，小鼠的背景相似，DiO小鼠被喂食高脂肪飲食15周。
圖1.8周對(duì)照的角膜上皮硬度（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差），假設(shè)角膜組織不可壓縮，泊松比為0.5。
角膜是的，因?yàn)樗鳛檠劬Φ恼凵浔砻姘l(fā)揮著基本功能，同時(shí)也在眼睛和外部環(huán)境之間保持了不透水的屏障。我們已經(jīng)表明，僵硬的變化隨著年齡的增長(zhǎng)以及肥胖小鼠（DiO）而發(fā)生，這是II型糖尿病前期的模型。之前，我們證明了DiO小鼠的角膜愈合速度明顯慢于對(duì)照C57BL6小鼠的角膜[]。我們?cè)诒臼指逯械臄?shù)據(jù)支持一份報(bào)告，即與對(duì)照組相比，糖尿病前期患者的角膜表面疾病發(fā)病率增加（分別為20.67%和3.33%;p < 0.05） ]。
我們證明，年齡匹配的動(dòng)物的上皮硬度與年齡和飲食有關(guān)。由于DiO動(dòng)物的上皮不那么堅(jiān)硬，我們反映了上皮完整性的變化，并對(duì)頂端上皮中常見的極性蛋白進(jìn)行了染色。我們檢查了未受傷和受傷的角膜，因?yàn)槠矫鏄O性可以通過幾種不同的線索引發(fā)，包括生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞外基質(zhì)的變化[。這些線索被認(rèn)為被轉(zhuǎn)化為定向遷移，這需要通過信號(hào)通路重組細(xì)胞成分。這些蛋白質(zhì)通常局限于遷移細(xì)胞的前部，導(dǎo)致細(xì)胞骨架變化，前緣膜突起和定向運(yùn)動(dòng)。這些變化在對(duì)照中觀察到，并在DiO角膜中被修改。先前，在其他組織中發(fā)現(xiàn)Crb3在分化的分泌細(xì)胞和分化的纖毛細(xì)胞中定位于頂端表。
在基底膜和基質(zhì)中也檢測(cè)到剛度的差異，通過基質(zhì)的剛度變化百分比發(fā)生變化。所有測(cè)量均在中央角膜中進(jìn)行。剛度變化的原因尚不清楚[]。表明隨著年齡的增長(zhǎng)，結(jié)締組織的特征是晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的積累，并且糖尿病患者受其積累的影響更大。這很重要，因?yàn)樗梢愿淖兓|(zhì)中豐富的蛋白質(zhì)（如膠原蛋白）的糖基化。他們對(duì)體外肌腱的研究表明，AGEs會(huì)降低組織的粘彈性。關(guān)于AGEs隨時(shí)間積累及其對(duì)膠原纖維和蛋白聚糖間距的影響的數(shù)據(jù)尚不清楚。
在最近的一篇綜述中，McKay等人指出，膠原蛋白交聯(lián)提供了維持角膜完整性的強(qiáng)度，衰老和糖尿病與膠原交聯(lián)的增加有關(guān)[]。然而，該評(píng)價(jià)隨后指出，雖然糖尿病人群的角膜滯后和角膜阻力因子升高，但存在不一致之處，他們提出這是由于人類患者群體的異質(zhì)性。糖尿病人群中的一致性極難控制，原因包括疾病的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間。出于這個(gè)原因，隨著時(shí)間的推移，對(duì)幾種不同的小鼠糖尿病模型的研究將很有趣，以解決這個(gè)問題。McKay確實(shí)報(bào)告了基質(zhì)厚度增加，根據(jù)研究的不同，剛度沒有或中度增加。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)DiO角膜Kneer等人（2018）的基質(zhì)厚度增加。
其他研究者假設(shè)這種增加與糖尿病有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)在其隊(duì)列中，LOX與糖尿病或肥胖無關(guān)[]。雖然我們測(cè)量了僵硬，但我們沒有測(cè)量LOX，需要在飲食的不同時(shí)間在DiO小鼠中檢查其表達(dá)。事實(shí)上，他們的體外研究表明，升高的LOX與缺氧的關(guān)聯(lián)更大。此外，Mankus等人（2012）在P2X7敲除小鼠中證明，LOX與III型膠原蛋白一樣升高，并不表示交聯(lián)增加[]。然而，在DiO小鼠和糖尿病人角膜中，P2X7 mRNA顯著升高7-10倍[]。這種升高表達(dá)的功能含義尚不清楚。在我們目前的研究中，沒有進(jìn)行膠原纖維測(cè)量，未來的研究將進(jìn)一步檢查基質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)。蛋白聚糖的硫酸化可能會(huì)發(fā)生變化，因?yàn)檫@也可能影響剛度。
我們的研究表明，DiO角膜傷口愈合受損可能反映了硬度的差異或基質(zhì)分子（如纖連蛋白）的變化。在對(duì)照中，與DiO角膜相比，沿著基質(zhì)神經(jīng)和對(duì)照前緣檢測(cè)到纖連蛋白。缺氧角膜中檢測(cè)到纖連蛋白減少，與對(duì)照組相比，角膜愈合延遲。甚至有可能缺乏順應(yīng)性反映了纖連蛋白的減少，因?yàn)轶w外研究表明，纖連蛋白的拉伸會(huì)導(dǎo)致其展開，導(dǎo)致隱秘結(jié)合位點(diǎn)暴露[]。納米壓痕儀在不同年齡和環(huán)境壓力下對(duì)相同背景的小鼠的使用為具有許多相互矛盾數(shù)據(jù)的領(lǐng)域提供了對(duì)照研究，因?yàn)槿祟惸Ｐ头浅?fù)雜。隨著時(shí)間的推移，將對(duì)肥胖和非肥胖小鼠的2型糖尿病模型進(jìn)行其他研究，以進(jìn)一步測(cè)試我們的結(jié)果。識(shí)別改變角膜完整性的特定因素將用于治療和預(yù)防變化?？傊芯拷悄さ奈锢硖卣鳎缭唤┯?，可以深入了解控制和患病條件下傷口修復(fù)的機(jī)制。
生物組織納米壓痕儀介紹
Piuma納米壓痕儀的核心部件是其安裝在壓痕移動(dòng)平臺(tái)上極其敏銳的壓痕探頭
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產(chǎn)品構(gòu)件詳細(xì)介紹：
1.PROBE探頭
納米壓痕儀核心:一個(gè)微加工工藝制作的光學(xué)壓痕探頭
2.SAMPLE樣品
從水凝膠到骨組織等，在大氣中或者浸沒在液體中
3.SAMPLEXYSTAGEXY樣品臺(tái)
在X-Y（12x12mm）范圍內(nèi)測(cè)試樣品
4.INDENTATIONSTAGE壓痕移動(dòng)臺(tái)
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為任何樣品以及容器創(chuàng)造空間
Piuma是一個(gè)創(chuàng)新的，具有成本效益的工具，用來表征生物材料、組織、細(xì)胞器、細(xì)胞層、軟骨、靜電支架、力學(xué)性能，3D打印材料，水凝膠等的微納米機(jī)械性能。
The Piuma 納米壓痕儀專為迎合生物材料以及組織研究人員和工程師的需求，提供易用性和便攜性，同時(shí)提供高精度、高通量和多樣化的數(shù)據(jù)。Optics11小型化的玻璃探針式壓頭，特別適合在液體中測(cè)量水合樣品。組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究者，Piuma納米壓痕儀是衡量他們感興趣材料剛度的一個(gè)解決方案。
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Piuma Nanoindenter是荷蘭Optics11公司出品的新型生物納米壓痕儀。主要應(yīng)用范圍為生物組織、生物支架、水凝膠、聚合物、細(xì)胞等軟物質(zhì)以及生物材料的機(jī)械性能研究。采用了新型探頭設(shè)計(jì)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)其他納米壓痕儀無法測(cè)試軟物質(zhì)的問題也解決了原子力顯微鏡在軟物質(zhì)測(cè)試中的數(shù)據(jù)波動(dòng)大，操作困難、制樣嚴(yán)苛等常見問題。更開創(chuàng)性的在壓痕儀中加入了動(dòng)態(tài)力學(xué)測(cè)試模式DMA，可以獲得材料與振動(dòng)頻率相關(guān)的儲(chǔ)存模量、損失模量和損失因子，用于研究材料在交變力作用下的滯后現(xiàn)象和力學(xué)損耗。
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